كيف تعمل تفاعلات البلمرة المتسلسلة لتضخيم الجينات

تفاعل البوليميراز المتسلسل (ير) هو تقنية جينية جزيئية لصنع نسخ متعددة من الجين وهو أيضا جزء من عملية التسلسل الجيني.

كيف يعمل البوليميراز سلسلة رد الفعل؟

يتم نسخ الجينات باستخدام عينة من الحمض النووي، والتكنولوجيا جيدة بما فيه الكفاية لجعل نسخ متعددة من نسخة واحدة من الجين وجدت في العينة. ير التضخيم من الجينات لجعل الملايين من النسخ، ويسمح للكشف عن وتحديد تسلسل الجينات باستخدام تقنيات بصرية على أساس حجم وشحن (+ أو -) من قطعة من الحمض النووي.

تحت ظروف التحكم، يتم إنشاء أجزاء صغيرة من الحمض النووي من الإنزيمات المعروفة باسم بوليميراز الحمض النووي، التي تضيف ديوكسينوكليوتيدس مجانية (دنتبس) إلى قطعة من الحمض النووي المعروفة باسم "القالب". حتى أجزاء أصغر من الحمض النووي، ودعا "الاشعال" تستخدم كنقطة انطلاق للبوليميراز. الاشعال هي قطع صغيرة من صنع الإنسان من الحمض النووي (أوليغوميرس)، وعادة ما بين 15 و 30 النيوكليوتيدات طويلة. وهي مصنوعة من خلال معرفة أو التخمين تسلسل الحمض النووي قصيرة في نهاية جدا من الجين يجري تضخيمها. خلال ير، يتم تسخين الحمض النووي يجري تسلسل والخيوط مزدوجة منفصلة. عند التبريد، ربط الاشعال للقالب (تسمى الصلب) وخلق مكان للبوليميراز للبدء.

-> <>>

تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل

كان تفاعل البوليميراز المتسلسل (ير) ممكنا من خلال اكتشاف الإنزيمات الحرارية (إنزيمات) التي تحافظ على السلامة الهيكلية والوظيفة بعد التسخين عند درجات حرارة عالية.

الخطوات المتبعة في تقنية ير هي كما يلي:

• يتم إنشاء خليط، مع تركيزات الأمثل من قالب الحمض النووي، انزيم البلمرة، الاشعال، و دنتبس. القدرة على تسخين الخليط دون تغيير طبيعة الانزيم يسمح لتغيير طبيعة الحلزون المزدوج من عينة الحمض النووي في درجات حرارة في حدود 94 درجة مئوية.

• بعد تمسخ، يتم تبريد العينة إلى نطاق أكثر اعتدالا، حوالي 54 درجة، مما يسهل الصلب (ملزمة) من الاشعال لقوالب الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل.
• في الخطوة الثالثة من الدورة، يتم إعادة تسخين العينة إلى 72 درجة، ودرجة الحرارة المثالية للبوليميراز تاق دنا، للاستطالة. خلال استطالة، البلمرة دنا يستخدم حبلا واحد الأصلي من الحمض النووي كقالب لإضافة دنتبس التكميلية إلى 3 'ينتهي من كل التمهيدي وتوليد قسم من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل في منطقة الجين من الفائدة.
• الاشعال التي صلبت لتسلسل الحمض النووي التي ليست تطابق تام لا تبقى صلب عند 72 درجة، مما يحد من استطالة الجين من الفائدة.

وتكرر هذه العملية من تغيير طبيعة، الصلب واستطالة متعددة (30-40) مرات، وبالتالي زيادة أضعافا مضاعفة عدد نسخ الجين المطلوب في الخليط.على الرغم من أن هذه العملية ستكون مملة جدا إذا أجريت يدويا، ويمكن إعداد العينات وحضنت في ثيرمويكلر للبرمجة، شائعة الآن في معظم المختبرات الجزيئية، ويمكن إجراء تفاعل ير الكامل في 3-4 ساعات.

كل خطوة تغيير طبيعة توقف عملية استطالة الدورة السابقة، وبالتالي اقتطاع حبلا جديدا من الحمض النووي والحفاظ على ما يقرب من حجم الجين المطلوب.

مدة دورة استطالة يمكن أن تكون أطول أو أقصر اعتمادا على حجم الجين من الفائدة، ولكن في نهاية المطاف، من خلال دورات متكررة من ير، فإن غالبية القوالب تقتصر على حجم الجين من الفائدة وحدها ، لأنها سوف تكون ولدت من منتجات كل من الاشعال.

هناك عدة عوامل مختلفة لنجاح ير التي يمكن التلاعب بها لتعزيز النتائج. الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لاختبار وجود المنتج ير هو أغاروس هلام الكهربائي. الذي يستخدم لفصل شظايا الحمض النووي على أساس حجم وشحن. ثم يتم تصور شظايا باستخدام الأصباغ أو النظائر المشعة.

تطور

منذ اكتشاف ير، تم اكتشاف بوليمرات الحمض النووي غير تاق الأصلي. بعض هذه لديها أفضل "التدقيق التصحيحي" القدرة أو أكثر استقرارا في درجات حرارة أعلى، وبالتالي تحسين خصوصية ير والحد من الأخطاء من إدراج دنتب غير صحيحة.

وقد تم تصميم بعض الاختلافات من ير لتطبيقات محددة وتستخدم الآن بانتظام في المختبرات الوراثية الجزيئية. بعض هذه هي ير في الوقت الحقيقي و ير-ترانسكريبتاس ير. وقد أدى اكتشاف ير أيضا إلى تطوير تسلسل الحمض النووي، البصمات الحمض النووي والتقنيات الجزيئية الأخرى.