طرق تنقية البروتين

جزء مهم من بحوث التكنولوجيا الحيوية هو استخدام تقنيات هندسة البروتين لتصميم أو تعديل البروتينات ذات الخصائص المثلى لتطبيقات صناعية محددة. للقيام بهذا العالم يجب أن تكون قادرة على عزل وتنقية البروتينات من الفائدة حتى تطابقها، وخصائص الركيزة، وردود الفعل مع بروابط أخرى، وأنشطة محددة يمكن دراستها.

درجة نقاوة البروتين المطلوبة تعتمد على الاستخدام النهائي المقصود من البروتين.

بالنسبة لبعض التطبيقات، يكون استخراج الخام كافيا. ومع ذلك، لاستخدامات أخرى، كما هو الحال في الأطعمة والمستحضرات الصيدلانية، مطلوب مستوى عال من النقاء. لتحقيق هذا يتم استخدام العديد من طرق تنقية البروتين عادة، في سلسلة من خطوات تنقية.

كل خطوة تنقية البروتين ينتج عادة في درجة معينة من فقدان المنتج. ولذلك، فإن استراتيجية مثالية تنقية البروتين هي واحدة التي يتم الوصول إلى أعلى مستوى من تنقية في أقل الخطوات. اختيار الخطوات التي تستخدم تعتمد على حجم، تهمة، الذوبان وغيرها من خصائص البروتين المستهدف. التقنيات التالية هي الأكثر ملاءمة لتنقية بروتين عصاري خلوي واحد. تنقية المجمعات البروتين عصاري خلوي هو أكثر تعقيدا وعادة ما يتطلب تطبيق أساليب مختلفة.

- (داخل الخلية) البروتينات هو إعداد

استخراج الخام

الخطوة الأولى في تنقية الخطوة الأولى في تنقية يحتوي المستخلص على خليط معقد من جميع البروتينات من السيتوبلازم الخلوي، وبعض الجزيئات الإضافية، العوامل المساعدة، والمواد المغذية. ويمكن استخدام المستخلص الخام لبعض التطبيقات في التكنولوجيا الحيوية، ومع ذلك، إذا كان النقاء قضية، يجب اتباع خطوات تنقية لاحقة. يتم إعداد مقتطفات البروتين الخام عن طريق إزالة الحطام الخلوي الناتجة عن تحلل الخلية، والذي يتحقق باستخدام المواد الكيميائية والانزيمات، صوتنة أو الصحافة الفرنسية.

تتم إزالة الحطام بواسطة الطرد المركزي، ويتم استرداد طاف. ويمكن الحصول على الاستعدادات الخام للبروتينات خارج الخلية ببساطة عن طريق إزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بالنسبة لبعض تطبيقات التكنولوجيا الحيوية، هناك طلب على

إنزيمات ثرموستابل

: إنزيمات يمكن أن تتسامح مع درجات حرارة عالية دون تغيير طبيعة، مع الحفاظ على نشاط معين عالي. الكائنات الحية التي تنتجها تسمى أحيانا إكستريموفيلز. وهناك طريقة سهلة لتنقية بروتين مقاوم للحرارة هي تحريف البروتينات الأخرى في الخليط عن طريق التسخين ثم تبريد المحلول (مما يسمح للإنزيم القابل للحرارة بإصلاحه أو إعادة حله إذا لزم الأمر، ويمكن بعد ذلك إزالة البروتينات المشوهة بواسطة الطرد المركزي. خطوات التنقية المتوسطة في الماضي، كانت الخطوة الثانية المشتركة لتنقية البروتين من مستخلص خام

هطول

في محلول ذو قوة تناضحية عالية (i.ه. حلول الملح). ويمكن إزالة الأحماض النووية في المستخلص الخام عن طريق ترسب المجاميع التي تشكلت مع كبريتات الستربتومايسين أو كبريتات البروتامين. وعادة ما يتم الهطول البروتين باستخدام كبريتات الأمونيوم والملح. بروتينات مختلفة سوف تترسب في تركيزات مختلفة من كبريتات الأمونيوم

. بشكل عام، البروتينات من ارتفاع الوزن الجزيئي تترسب في تركيزات أقل من كبريتات الأمونيوم. هطول الأمطار الملح لا يؤدي عادة إلى بروتين عالي النقاء ولكن يمكن أن تساعد في القضاء على بعض البروتينات غير المرغوب فيها في خليط وتركيز العينة. ثم يتم إزالة الأملاح في الحل عن طريق غسيل الكلى من خلال أنابيب السليلوز التي يسهل اختراقها، الترشيح، أو هلام الاستبعاد اللوني. غالبا ما تستفيد بروتوكولات التكنولوجيا الحيوية الحديثة من العديد من المجموعات المتاحة تجاريا التي توفر الحلول الجاهزة للإجراءات القياسية. وغالبا ما يتم تنقية البروتين باستخدام مرشحات وأعدت أعمدة الترشيح هلام. كل ما عليك القيام به هو اتباع التعليمات وإضافة الحجم الصحيح من الحل الصحيح وانتظر طول المحدد من الوقت في حين جمع إلوانت (ما يخرج في الطرف الآخر من العمود) في أنبوب اختبار جديد.

أساليب كروماتوغرافي يمكن تطبيقها باستخدام أعمدة مقاعد البدلاء الأعلى أو معدات هبلك الآلي. ويمكن أن يتم الفصل عن طريق هبلك عن طريق عكس المرحلة، والتبادل الأيوني أو أساليب استبعاد الحجم، والعينات الكشف عن طريق مجموعة الصمام الثنائي أو تكنولوجيا الليزر.

تصور البروتين وتقييم التنقية

• عكس المرحلة اللوني

  (ريك) يفصل البروتينات على أساس

  • النسبية للماء . هذه التقنية انتقائية للغاية ولكن يتطلب استخدام المذيبات العضوية. يتم تحريف بعض البروتينات بشكل دائم عن طريق المذيبات وسوف تفقد وظائف أثناء ريك. ولذلك لا ينصح هذا الأسلوب لجميع التطبيقات، وخاصة إذا كان من الضروري للبروتين الهدف للاحتفاظ النشاط. كروماتوجرافيا التبادل الأيوني يشير إلى فصل البروتينات على أساس
  • شحن . ويمكن إما أن تكون الأعمدة مستعدة لتبادل التبادل الأيوني أو تبادل الموجبة الكاتيونية. أنيون إكسهانج تحتوي الأعمدة على مرحلة ثابتة مع شحنة موجبة تجذب البروتينات المشحونة سلبا. تبادل الموجبة الكاتيونية الأعمدة هي العكس، سالبة الشحنة الخرز التي تجذب البروتينات موجبة الشحنة. يتم شطف البروتين المستهدف (ق) عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني في العمود، مما يؤدي إلى تغيير أو تحييد المجموعات الوظيفية المشحونة من كل بروتين. كروماتوجرافيا الاستبعاد ( الترشيح الهلامي
  • ) يفصل البروتينات الأكبر من تلك الصغيرة حيث أن الجزيئات الأكبر تسير بشكل أسرع من خلال البوليمر المتصالب في عمود اللوني. البروتينات الكبيرة لا تتناسب مع مسام البوليمر في حين أن البروتينات الصغيرة تفعل، وتستغرق وقتا أطول للسفر من خلال العمود اللوني، عبر طريقها أقل مباشرة. يتم جمع شطافة في سلسلة من أنابيب فصل البروتينات على أساس الوقت شطف. هلام الترشيح هو أداة مفيدة لتركيز عينة البروتين منذ يتم جمع البروتين المستهدف في حجم شطف أصغر مما كان يضاف في البداية إلى العمود.ويمكن استخدام تقنيات ترشيح مماثلة أثناء إنتاج البروتين على نطاق واسع بسبب فعاليتها من حيث التكلفة. اللوني الانجذاب هو تقنية مفيدة جدا ل "تلميع" أو استكمال عملية تنقية البروتين. الخرز في العمود اللوني هي عبر ربط ليغاندس التي ترتبط على وجه التحديد إلى البروتين المستهدف. ثم تتم إزالة البروتين من العمود عن طريق الشطف مع محلول يحتوي على بروابط حرة. هذا الأسلوب يعطي أنقى النتائج وأعلى نشاط معين مقارنة مع غيرها من التقنيات.
  • سدز-بادج هو بولي أكريلاميد هلام الكهربائي، أجريت في وجود سدز (كبريتات دوديسيل الصوديوم) الذي يربط إلى البروتينات مما يتيح لهم صافي تهمة سلبية كبيرة. منذ اتهامات جميع البروتينات متساوية إلى حد ما، وهذا الأسلوب يفصل بينهما تقريبا تقريبا على أساس الحجم. وغالبا ما يستخدم سدز-بادج لاختبار نقاء البروتين بعد كل خطوة في سلسلة. كما يتم إزالة البروتينات غير المرغوب فيها تدريجيا من الخليط، يتم تقليل عدد العصابات تصور على هلام سدز-بادج، حتى لا يكون هناك سوى فرقة واحدة تمثل البروتين المطلوب.
• إمونوبلوتينغ هو تقنية التصور البروتين تطبيقها في تركيبة مع اللوني تقارب. وتستخدم الأجسام المضادة لبروتين معين كما بروابط على عمود اللوني تقارب. يتم الاحتفاظ البروتين المستهدف على العمود، ثم إزالتها عن طريق الشطف العمود مع محلول الملح أو عوامل أخرى. تساعد الأجسام المضادة المرتبطة بالعلامات المشعة أو الصبغية في الكشف عن البروتين المستهدف بمجرد فصله عن بقية الخليط.
• المصادر: زوباي G. 1988. الكيمياء الحيوية، الطبعة الثانية. ماكميلان، النشر، Co.، نيويورك، ني، أوسا.

أمرشام فارماسيا بيوتيش. 1999. بروتين تنقية كتيب، الطبعة أب. أميرشام فارماسيا بيوتيش Inc. نيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية. هتب: // شبكة الاتصالات العالمية. دكاك. uiowa. ايدو / دونلسون /٪ 20items قاعدة البيانات / protein_purification_handbook. قوات الدفاع الشعبي.